انکلوژن بوڈ پیوریفیکیشن میں ہولو فائبر کے کئی منفرد طریقوں کی مختصر گفتگو

انکلوژن باڈیز (IB) اعلی کثافت، غیر حل پذیر پروٹین کے ذرات ہیں جو جھلیوں میں لپیٹے جاتے ہیں جب غیر ملکی جین پروکریوٹک خلیات میں ظاہر ہوتے ہیں، خاص طور پر Escherichia coli میں۔ جب ایک خوردبین کے تحت مشاہدہ کیا جاتا ہے، تو IB ایک اعلی اضطراری خطہ ہے، جو ظاہر ہے کہ سائٹوپلازم کے دیگر اجزاء سے مختلف ہے۔

شمولیتی جسم کی تشکیل نسبتاً پیچیدہ ہے، جس کا تعلق سائٹوپلازم میں پروٹین کی پیداوار کی شرح سے ہے، نئے پیدا ہونے والے پیپٹائڈس کا ارتکاز زیادہ ہے، اور فولڈ کرنے کے لیے کافی وقت نہیں ہے، تاکہ بے ساختہ پروٹین کے مجموعے بن سکیں۔ انکلوژن باڈیز بنیادی طور پر پروٹینز پر مشتمل ہوتی ہیں، جن میں سے 50% سے زیادہ کلون شدہ مصنوعات ہیں۔ ان مصنوعات کی بنیادی ساخت مکمل طور پر درست ہے، لیکن سہ جہتی ترتیب غلط ہے، اس لیے کوئی حیاتیاتی سرگرمی نہیں ہے۔ شمولیت کے جسم کا سائز 0 ہے۔5-1μm، پانی میں اگھلنشیل، صرف denaturants جیسے یوریا، guanidine hydrochloride، وغیرہ میں گھلنشیل۔

ای کولی میں، انکلوژن باڈیز سیل کے دو مقامات پر ہو سکتی ہیں: سائٹوپلازم اور پیریفرل سائٹوپلازم۔ خلیے میں شامل جسموں کا مقام اور خصوصیات اس بات پر منحصر ہیں کہ پروٹین کا اظہار کیسے کیا جاتا ہے۔

ای کولی کے سائٹوپلازم میں شمولیت عام طور پر قطر میں {{0}}.2 سے 1.5μm تک ہوتی ہے، اور مختلف پروٹینوں کے قطر مختلف ہوتے ہیں، جیسے کہ انٹرفیرون کا سائز 0.811μm، اور اس کا سائز prorennet 1.281μm ہے۔ بعض صورتوں میں، کچھ شمولیتی لاشوں کا قطر E. coli کے قطر سے بڑا ہوتا ہے، جو E. coli کو ایک پھیلاؤ دیتا ہے۔ عام طور پر، ایک سیل میں صرف ایک شمولیتی جسم ہوتا ہے۔

 

شمولیت جسم کی صفائی

 

شامل کرنے کے جسم کو صاف کرنے کا عمل عام طور پر ہے:

سیل کرشنگ:

سیل کرشنگ کی عمومی ٹیکنالوجی یہ ہے: تیز رفتار ٹشو کرشنگ، گلاس ہوموجنائزر ہوموجنائزیشن، الٹراسونک ٹریٹمنٹ، بار بار فریز تھرو طریقہ، کیمیائی علاج (عام طور پر لائسوزیم ٹریٹمنٹ کا استعمال)۔

 

شامل جسم کی دھلائی:

انکلوژن باڈیز غیر فعال ٹھوس ذرات ہیں جو بیکٹیریا کے ذریعہ ظاہر کردہ پروٹین کے انٹرا سیلولر جمع سے تشکیل پاتے ہیں، جو عام طور پر بے ساختہ، ناقابل حل شکل میں موجود ہوتے ہیں۔ شامل کرنے والے جسم میں، حقیقی ہدف پروٹین کا صرف تقریباً 50% حصہ ہوتا ہے، اور بقیہ میں لپڈز، لیپوپولیساکرائیڈز، نیوکلک ایسڈز اور ہیٹروپروٹینز ہوتے ہیں، جو انکلوژن باڈی سے جڑے ہوتے ہیں اور انکلوژن باڈی پروٹین کی بحالی کو متاثر کرتے ہیں۔ لہذا، ڈینیچریشن سے پہلے دھونا ایک بہت ضروری قدم ہے۔

اس کے علاوہ، انکلوژن باڈیز کی دھلائی ریکومبیننٹ پروٹین کی ری فولڈنگ پیداوار کو بڑھانے میں مددگار ہے۔ نجاست کو دور کر کے، تجدید کاری کے عمل میں حائل رکاوٹوں کو کم کیا جا سکتا ہے، تاکہ پروٹین کو زیادہ مؤثر طریقے سے فولڈ اور صحیح طریقے سے جمع کیا جا سکے، اس طرح پروٹین کی سرگرمی اور کام کو بہتر بنایا جا سکے۔

عام طور پر غیر جانبدار صابن کا 1% سے کم استعمال کیا جاتا ہے، جیسے کہ Tween، Triton، Urea اور NP40 plus EDTA اور reducing agents 2-mercaptotreitol (DTT)، -mercaptoethanol کئی بار دہرایا جاتا ہے، کیونکہ ڈٹرجنٹ دھونے کی صلاحیت کو بڑھاتا ہے۔ حل کی ionic طاقت میں اضافہ، شامل لاشوں کی دھونے میں ہو سکتا ہے آئنک طاقت کو بڑھانے کے لیے NaCl شامل کیا۔

انکلوژن باڈیز کو سینٹرفیوگریشن یا فلٹریشن کے ذریعے سیل بریک ڈاؤن سلوشن کے دیگر اجزاء کو ہٹانے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے، یہ دونوں انکلوژن باڈیز کی مختلف جسمانی خصوصیات سے فائدہ اٹھاتے ہیں۔

 

سینٹرفیوگریشن:

انکلوژن باڈی پروٹینز سیل کے ٹکڑوں کے ایک ہی حجم سے زیادہ گھنے ہوتے ہیں، اس لیے انکلوژن باڈی کو سینٹرفیوگریشن کے ذریعے باقی خلیے سے الگ کیا جا سکتا ہے۔ مسلسل سینٹرفیوگریشن صنعتی پیداوار میں انکلوژن باڈیز حاصل کرنے کے لیے سب سے زیادہ استعمال ہونے والا آپریشن ہے۔ چونکہ خلیے کے ٹکڑوں کی کثافت انکلوژن باڈی سے کم ہوتی ہے، لہٰذا انکلوژن باڈی سے تلچھٹ کی شرح کم ہوتی ہے۔ مسلسل معطلی اور سینٹرفیوگریشن زیادہ تر شمولیتی جسم کو سینٹری فیوج کر سکتی ہے، جبکہ سیل کے ٹکڑے آہستہ آہستہ ہٹا دیے جاتے ہیں۔
فلٹریشن (ٹینجینٹل فلو فلٹریشن): انکلوژن باڈیز اور گھلنشیل پروٹین کے مختلف مالیکیولر سائز کی وجہ سے، فلٹریشن کا طریقہ استعمال کیا جا سکتا ہے، جو آپریٹنگ لاگت کو کم کر سکتا ہے اور اس کی پیمائش کو آسان بنا سکتا ہے۔ ٹینجینٹل فلو فلٹریشن (TFF) ٹرانس میبرن پریشر فرق سے چلتی ہے۔ جھلی کے تاکنے کے سائز سے چھوٹے مادے اور نجاست جھلی سے گزرتے ہیں، جبکہ بڑے ذرات والے خلیات جیسے نجاست پھنس جاتے ہیں۔ عام طور پر فلٹریشن واشنگ کے لیے استعمال ہونے والا جھلی کا یپرچر 0.1μm ہے۔ کھوکھلی فائبر ٹینجینٹل فلو مائیکرو فلٹریشن مائع مواد کے اعلی ٹھوس مواد سے براہ راست نمٹ سکتی ہے، کم اقدامات، سادہ آپریشن، جھلی کو ماڈیولر خودکار پیداوار کی ضروریات کے مطابق صفائی، آلات کی سرمایہ کاری اور آپریٹنگ اخراجات کو کم کرنے کے ذریعے بار بار استعمال کیا جا سکتا ہے۔

 

گائیڈلنگ ہولو فائبر کالمز کا استعمال کرتے ہوئے انکلوژن باڈی واشنگ کے لیے درج ذیل ایک درخواست کا کیس ہے۔

ہم نے 94 سینٹی میٹر2 0۔ دھونے کے پورے عمل میں، ٹارگٹ پروٹین کی بازیابی کی شرح اور جھلی کے بہاؤ کی کمی کی چھان بین کی گئی۔

0-71منٹ ارتکاز کا عمل ہے، 71-224منٹ دھونے اور فلٹریشن کا عمل ہے۔ مائیکرو فلٹریشن کے پورے عمل کے دوران، ٹی ایم پی میں بتدریج اضافہ ہوا، مائع داخل کرنے کی رفتار میں کوئی تبدیلی نہیں آئی، اور مواد کا اوسط بہاؤ 12LMH تھا۔

نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ ہدف پروٹین مکمل طور پر پھنس گیا تھا، اور ہدف پروٹین کی بازیابی کی شرح 90٪ سے زیادہ تھی۔ گائیڈنگ ہولو فائبر کالم اس ایپلی کیشن کے لیے مستحکم اور موزوں ہیں۔

 

شامل جسم کی تحلیل:

انکلوژن باڈیز کو عام طور پر منحرف ایجنٹ یوریا یا گوانائیڈائن ہائیڈروکلورائیڈ کی حالت میں تحلیل کیا جاتا ہے، اور تحلیل شدہ انکلوژن باڈی پروٹین مکمل طور پر منحرف ہو جاتے ہیں، یعنی سوائے بنیادی ڈھانچے اور ہم آہنگی بانڈز کو برقرار رکھنے کے، تمام ہائیڈروجن بانڈز اور ہائیڈرو فوبک بانڈز تباہ ہو جاتے ہیں۔ طرف کی زنجیریں مکمل طور پر بے نقاب ہیں۔

یوریا اور گوانیڈائن ہائیڈروکلورائیڈ درمیانے درجے کی طاقت والے ڈینٹورنٹ ہیں، جنہیں ڈائیلاسز اور الٹرا فلٹریشن کے ذریعے آسانی سے ہٹا دیا جاتا ہے۔ یوریا کی عمومی ارتکاز 8-10M، guanidine ہائڈروکلورائڈ 6-8M. یوریا کی تحلیل میں غیر آئنائزیشن کے فوائد ہیں، غیر جانبدار، کم لاگت، رینیچریشن کے بعد پروٹین کو ہٹانے سے پروٹین کی بڑی مقدار میں ترسیب نہیں ہو گی، اور تحلیل شدہ انکلوژن باڈیز کو مختلف قسم کے کرومیٹوگرافک طریقوں سے پاک کیا جا سکتا ہے، اس لیے اسے بڑے پیمانے پر استعمال کیا جا رہا ہے۔ .

 

انکلوژن باڈی پروٹین ری فولڈنگ:

تحلیل شدہ ریکومبیننٹ پروٹین کو ایک فعال پروٹین بنانے کے لیے صحیح طریقے سے جوڑنا چاہیے۔ تجدید کاری کی تکنیکوں میں پروٹین کے محلول کو قریبی نیوٹرل میں گھٹانا، ڈینیچرنٹ کو ہٹانا، کالم پر رینیچریشن، اور جیل فلٹریشن کرومیٹوگرافی شامل ہیں۔ ان میں سے، پروٹین کے محلول کو تقریباً غیرجانبدار تک پتلا کرنا اور ڈینیچرنٹ کو ہٹانا رینیچریشن کا ایک عام کلاسیکی طریقہ ہے، خاص طور پر ڈیلیوشن رینیچریشن طریقہ استعمال کی شرح سب سے زیادہ ہے۔

Denaturant ہٹانا:

ڈائیلاسز: فائدہ یہ ہے کہ حجم میں اضافہ نہیں ہوتا ہے، اور خارجی پارگمی مائع کے ارتکاز کو بتدریج کم کرکے denaturant کے اخراج کی شرح کو کنٹرول کیا جاتا ہے، لیکن اس میں کافی وقت لگتا ہے اور غیر فعال پروٹین کے مجموعے بنانے میں آسان ہے، جو کہ اس کے لیے موزوں نہیں ہے۔ بڑے پیمانے پر آپریشن اور پیداوار کے پیمانے پر لاگو نہیں کیا جا سکتا.

الٹرا فلٹریشن (TFF) : ڈائلیسس کی رفتار کو کنٹرول کرنا آسان ہے، چاہے تحقیق اور ترقی ہو، پائلٹ ٹیسٹ ہو یا پروڈکشن، الٹرا فلٹریشن (TFF) کے ذریعے denaturants (مائع تبدیلی + ارتکاز) کو ہٹا سکتا ہے۔

 

شامل جسم پروٹین صاف کرنا:

تزئین و آرائش کے بعد پروٹین پیوریفیکیشن کے طریقے حل پذیر پروٹین پیوریفیکیشن سے ملتے جلتے ہیں، یعنی آئن ایکسچینج کرومیٹوگرافی، جیل فلٹریشن کرومیٹوگرافی، ایفینیٹی کرومیٹوگرافی، امونیم سلفیٹ سالٹ آؤٹ پریپیٹیشن وغیرہ۔

شمولیت والے جسموں میں کوئی حیاتیاتی سرگرمی نہیں ہوتی ہے، پروٹین کی سرگرمی کے نقصان کے بارے میں فکر کرنے کی ضرورت نہیں ہے، اور زیادہ مقدار میں اظہار سیل کی موت کا باعث نہیں بنے گا، اور پروٹیز حملے کے خلاف مزاحمت کو زیادہ سے زیادہ بناتا ہے۔ جیولنگ ہولو فائبر کو شامل کرنے والے جسموں کے بہاو صاف کرنے کے عمل میں لچکدار طریقے سے لاگو کیا جاسکتا ہے۔ شمولیت کے جسم کو دھونے کے مرحلے میں، سینٹری فیوگل واشنگ کے مقابلے میں بہترین کارکردگی، ٹینجینٹل فلو فلٹریشن واشنگ کے لیے نو ایج ٹیکنالوجی مائیکرو فلٹریشن ہولو فائبر کا استعمال عمل کے وقت کو بہت کم کر سکتا ہے، اور عام بحالی کی شرح 90 فیصد سے زیادہ تک پہنچ سکتی ہے۔ جیولنگ ہولو فائبر کو انکلوژن باڈیز کے پروٹین رینیچریشن مرحلے میں بھی استعمال کیا جا سکتا ہے۔ مائیکرو فلٹریشن ہولو فائبر کے ذریعے فلٹر کیے گئے فیڈ مائع کی ٹربائیڈیٹی نمایاں طور پر کم ہو جائے گی، اور پروٹین کی بحالی کی شرح زیادہ ہے۔ الٹرا فلٹریشن ہولو فائبر کا استعمال نہ صرف ڈینٹورینٹس کو ہٹا سکتا ہے بلکہ کرومیٹوگرافک نمونہ لوڈنگ کا وقت بھی کم کر سکتا ہے، تاکہ وقت کی بچت ہو، فلر کا حجم کم ہو اور پیداواری لاگت کو کم کیا جا سکے۔ مائیکرو فلٹریشن/الٹرا فلٹریشن ہولو فائبر کی بازیابی کی شرح مختلف مواد کے ساتھ مختلف ہوتی ہے، اور عام بحالی کی شرح 90-95% تک پہنچ سکتی ہے۔

گائیڈلنگ ٹیکنالوجی متعلقہ جائزوں کے لیے ٹیسٹ کٹس کی درخواست کرنے کا خیرمقدم کرتی ہے۔

 

گائیڈلنگ کے بارے میں

گائیڈلنگ ٹیکنالوجی ایک قومی ہائی ٹیک انٹرپرائز ہے جو بائیو فارماسیوٹیکلز، سیل کلچر، بائیو میڈیسن کی تطہیر اور ارتکاز، تشخیص اور صنعتی سیالوں پر توجہ مرکوز کرتی ہے۔ ہم نے کامیابی کے ساتھ سینٹری فیوگل فلٹر ڈیوائسز، الٹرا فلٹریشن اور مائیکرو فلٹریشن کیسٹس، وائرس فلٹر، TFF سسٹم، ڈیپتھ فلٹر، ہولو فائبر وغیرہ تیار کیے ہیں۔ ہماری جھلیوں اور جھلیوں کے فلٹر بڑے پیمانے پر ارتکاز، نکالنے اور پری فلٹریشن، مائیکرو فلٹریشن، الٹرا فلٹریشن اور نینو فلٹریشن میں استعمال ہوتے ہیں۔ ہماری بہت سی پروڈکٹ لائنیں، چھوٹی، واحد استعمال کی لیبارٹری فلٹریشن سے لے کر پروڈکشن فلٹریشن سسٹم، سٹرلٹی ٹیسٹنگ، فرمینٹیشن، سیل کلچر اور مزید، جانچ اور پیداوار کی ضروریات کو پورا کرتی ہیں۔ گائیڈلنگ ٹیکنالوجی آپ کے ساتھ تعاون کرنے کے منتظر ہے!