ریکومبیننٹ ایسچریچیا کولی کے ہائی ڈینسیٹی فرمینٹیشن لائسیٹ کی وضاحت کے عمل پر مطالعہ

 

کرومیٹوگرافی میں مادی سیال کی مداخلت کو کم کرنے اور ٹارگٹ پروٹین کی بازیابی کو بہتر بنانے کے لیے، ریکومبیننٹ Escherichia coli کے دو تناؤ کے ہائی ڈینسٹی فرمینٹیشن lysate کی وضاحت کے عمل کا مطالعہ کیا گیا۔ اسٹرین BL21-HP1036 اور BL21-palA جو کہ Streptococcus suis اور Haemophilus parasuis کے کلیدی جینوں کا اظہار کرتے ہیں کو منتخب کیا گیا تھا۔ ٹینجینٹل بہاؤ کا عمل، تیز رفتار سینٹرفیوگریشن عمل اور جھلی کیسٹ کی وضاحت کے عمل کو ٹربائڈیٹی اور الیکٹروفورسس کا پتہ لگانے کے ذریعے پروٹین کی پیداوار کا اندازہ کرنے کے لیے استعمال کیا گیا۔

 

نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ BL21-HP1036, BL21-palA ہائی ڈینسٹی فرمینٹیشن لیسیٹ جو Streptococcus suis اور Haemophilus parasuis کے کلیدی جینوں کو ظاہر کرتا ہے، کو جھلی کیسٹ فلٹریشن اور سینٹرفیوگریشن کے ذریعے واضح کیا گیا تھا، اور پروٹین کی پیداوار %00 سے زیادہ تھی۔ جو کرومیٹوگرافک مداخلت کو مؤثر طریقے سے کم کر سکتا ہے اور بحالی کی شرح کو بہتر بنا سکتا ہے۔

 

تعارف

اس وقت، Streptococcus suis (SS) اور Haemophilus parasuis (HPS) سور فارموں میں سب سے زیادہ عام بیکٹیریل بیماری کے جراثیم ہیں، جو سور کی صنعت کو بہت نقصان پہنچاتے ہیں۔ SS کو کل 35 سیرو ٹائپس 1-34 اور 1/2 میں تقسیم کیا جا سکتا ہے، اور HPS کو 1-15 سیرو ٹائپس میں تقسیم کیا جا سکتا ہے، اور دونوں اکثر مخلوط ہوتے ہیں، بنیادی طور پر سوائن پولی سیروسائٹس، گٹھیا، گردن توڑ بخار، اینڈو کارڈائٹس کا باعث بنتے ہیں۔ ، بیکٹیریل سیپٹیسیمیا اور برونکائٹس۔

 

Streptococcus suis اور Haemophilus parasuis کے سیرو ٹائپس کی بڑی تعداد کی وجہ سے، مختلف سیرو ٹائپس کے درمیان کراس پروٹیکشن کمزور ہے، اور اینٹی بائیوٹک کے ساتھ علاج کرنے پر اینٹی بائیوٹک مزاحمت نمایاں طور پر بڑھ جائے گی، جو علاج کے اثر کو متاثر کرے گی۔

 

SS اور HPS کو روکنے کے لیے ویکسین ایک مؤثر ذریعہ بن گئی ہیں۔ غیر فعال ویکسین، ٹینیویٹڈ ویکسین، لائیو ویکسین، سبونائٹ ویکسین اور جینیاتی طور پر انجینئرڈ ویکسین موجود ہیں، لیکن غیر فعال ویکسین اور ٹینیویٹڈ ویکسین بنیادی طور پر مارکیٹ میں ہیں، اور ان کا مدافعتی تحفظ اچھا ہے، لیکن کراس پروٹیکشن واضح نہیں ہے۔ Subunit vaccine streptococcus suis کے خلاف ایک نئی قسم کی ویکسین ہے، جو کہ مضبوط کراس پروٹیکشن اور کم قیمت والی ویکسین کی ایک نئی قسم ہے۔ Streptococcus suis اور Haemophilus parasuis کے subunit ٹیکوں کی تحقیق اور ترقی Streptococcus suis اور Haemophilus parasuis کی روک تھام اور کنٹرول کے مسائل کا ایک بہترین حل فراہم کرتی ہے جو چین میں سور کی صنعت کو متاثر کرتے ہیں۔

 

Streptococcus suis اور Haemophilus parasuis subunit ویکسین کو ریکومبیننٹ Escherichia coli کے ذریعے اعلی کثافت کے ابال کا نشانہ بنایا جاتا ہے۔ لائسیٹ کی وضاحت کا ہدف پروٹین کی پیداوار پر بہت اچھا اثر پڑتا ہے، لیکن کچھ متعلقہ رپورٹس موجود ہیں۔ ابال اور طہارت کے عمل کے وضاحتی مرحلے کو کیسے محسوس کیا جائے یہ ایک اہم کام ہے۔ اس مقالے میں، Recombinant E. coli BL21-HP1036, BL21-palA اعلی کثافت ابال کو بطور آبجیکٹ، اس بات کا مطالعہ کرنے کے لیے کہ کس طرح واضح کرنے والے محلول کی ٹربائڈیٹی کو مؤثر طریقے سے کم کیا جائے، پروٹین کی پیداوار کو بہتر بنایا جائے۔ نظریاتی بنیاد اور تکنیکی مدد فراہم کرنے کے لئے صنعتی کرشنگ اور وضاحتی ٹیکنالوجی کے حصول کے لیے Streptococcus suis subunit ویکسین ابال کا عمل۔

 

1. مواد اور طریقے

1.1 مواد

 

1.1.1 تناؤ

Streptococcus suis اور Heemophilus parasuis strains BL21-HP1036, BL21-pa-lA

 

1.1.2 مین میڈیا اور ری ایجنٹس

خمیر کا عرق اور پورپوز؛ سوڈیم کلورائد؛ کنامیسن، آئی پی ٹی جی؛ فارملڈہائڈ سے؛ SDS-PAGE جیل کٹ۔

 

1.1.3 اہم ٹیسٹ کا سامان

اعلی کثافت خمیر؛ تیز رفتار سینٹری فیوج؛ الیکٹروفورسس اپریٹس؛ الٹرا وایلیٹ جیل امیجنگ سسٹم؛ الٹراسونک کولہو; چھوٹا تیز رفتار سینٹری فیوج؛ الٹرا وایلیٹ سپیکٹرو فوٹومیٹر؛ مسلسل درجہ حرارت ہلانے والی میز؛ وابستگی کرومیٹوگرافی کا سامان۔

 

1.2 طریقے

 

1.2.1 اعلی کثافت ابال کی ثقافت

کوالیفائیڈ ریکومبیننٹ کولیفارم سٹرینز BL21-HP1036 اور BL21-pa-lA کو مصنوعی میڈیم پر 2%(V/V) پر ٹیکہ لگایا گیا تھا اور 35-40 h کے لیے 37 ڈگری پر کلچر کیا گیا تھا۔

 

1.2.2 ریکومبیننٹ پروٹین حوصلہ افزائی اظہار

جب ابال کا حل OD{{0}}±0.1، انڈکشن شروع ہوا، انڈکشن کا درجہ حرارت 35 ڈگری ±0.5 ڈگری تھا، اور کلچر شامل کرنے کے 10 گھنٹے بعد ختم ہو گیا تھا۔

 

1.2.3 ہائی پریشر یکساں کرشنگ اور سینٹرفیوگریشن

غیر فعال ہونے کا امتحان پاس کرنے والے بیکٹیریا مائع کو سیل کریکنگ کے لیے بالترتیب 100 ~ 150 MPa کے دباؤ کے ساتھ ایک ہائی پریشر ہوموجنائزر کے ذریعے کچل دیا گیا۔ کچلنے کے بعد، پسے ہوئے مائع کو کم درجہ حرارت پر رکھا جاتا تھا۔

سپرنٹنٹ کو ہائی سپیڈ کے ساتھ سینٹری فیوج کے ذریعے حاصل کیا گیا تھا، سینٹری فیوگل سپیڈ: 15000 rpm، درجہ حرارت کنٹرول: 10 ڈگری ~ 15 ڈگری، انجیکشن سپیڈ: 0.5~1 L/min، بالترتیب، سپرنٹنٹ کو جمع کیا گیا تھا، اور سپرنٹنٹ کنٹینرز سے بھرا ہوا تھا جس نے اینڈوٹوکسین کو ہٹا دیا تھا۔

 

1.2.4 مائیکرو فلٹریشن جھلی کیسٹ کی وضاحت

جھلی کو ایک سمت میں 10L صاف پانی سے دھویا گیا، اور ٹینجینٹل فلو فلٹریشن کیا گیا۔ سینٹرفیوگیشن کے بعد ٹوٹے ہوئے بیکٹیریل سسپنشن کا 300 ملی لیٹر پائپ لائن سینٹری فیوج سے لیا گیا اور 0.45um مائیکرو فلٹریشن میمبرین کیسٹ سے واضح کیا گیا۔ ٹربائڈیٹی کی پیمائش بالترتیب نمونے لینے سے کی گئی، اور سینٹرفیوگریشن کے بعد ٹربائڈیٹی، مائیکرو فلٹریشن میمبرین کیسٹ میں واضح مائع کی ٹربائڈیٹی اور مائیکرو فلٹریشن میمبرین کیسٹ میں مرتکز مائع کی ٹربائڈیٹی کا موازنہ کیا گیا۔ پروٹین کی پیداوار کا اندازہ کرنے کے لیے نمونے کے پروٹین کے مواد کا پتہ کرومیٹوگرافی اور الیکٹروفورسس کے ذریعے کیا گیا۔

 

مرحلہ 2: نتائج

2.1 وضاحتی ڈیٹا اور BL21-HP1036 اور BL21-palA پروٹین کے ٹیسٹ کے نتائج

FIG میں نتائج۔ 1 سے پتہ چلتا ہے کہ BL21-HP1036 اور BL21-palA ریکومبیننٹ Escherichia coli کرشنگ سیال کی ٹربائیٹی بالترتیب 4 500 NTU اور 4 000 NTU سے کم ہو کر 1970 NTU اور 520 NTU ہو گئی، ٹیوب سینٹرفیوگریشن کے بعد۔ BL21-HP1036 اور BL21-palA ریکومبیننٹ Escherichia coli کی ٹربائیٹی کو مائیکرو فلٹریشن میمبرین کیسٹ طریقہ سے 25 NTU اور 1.28 NTU تک کم کر دیا گیا۔ یہ دیکھا جا سکتا ہے کہ مائیکرو فلٹریشن میمبرین کیسٹ ٹینجینٹل فلو فلٹریشن اور آپٹمائزڈ اوپن فلو چینل کا استعمال روایتی سنٹری فیوج فلٹریشن کے مقابلے کرومیٹوگرافک مائع کی اینڈوٹوکسین، واسکاسیٹی اور ٹربائڈیٹی کو کم کرنے پر اچھا اثر ڈالتا ہے، اور ٹوٹے ہوئے ریکومبینینٹ کو کو نمایاں طور پر کم کر سکتا ہے۔ اور نیوکلک ایسڈ۔

 

2.2 BL21-HP1036 اور BL21-palA نمونوں کی پروٹین کی بازیافت

جدول 1 سے پتہ چلتا ہے کہ ریکومبیننٹ Escherichia coli BL21-HP1036 پروٹین مائیکرو فلٹریشن کلیفائیڈ سلوشن اور مائیکرو فلٹریشن میمبرین سے ڈھکے ہوئے مرتکز سپرناٹینٹ دونوں میں موجود ہے، اور مائیکرو فلٹریشن واضح محلول سے پروٹین کی بازیافت کے بعد پروٹین کی کل پیداوار اور مرتکز سپرنا تقریباً 88.5 فیصد ہے۔ BL21-palA پروٹین مائیکرو فلٹریشن ایکزوڈیٹ واضح محلول میں بھی موجود تھا اور مائیکرو فلٹریشن میمبرین کیسٹ سے ڈھکے ہوئے مرتکز محلول کے سپرنٹنٹ۔ BL21-PALa پروٹین کی کل پیداوار 81.5% تھی۔

 

3. نتیجہ

اس مقالے میں، Streptococcus suis اور Haemophilus parasuis کے کلیدی جین BL{{0}}HP1036 اور BL21-palA کو ظاہر کرنے والے تناؤ بالترتیب اعلی کثافت کے ابال سے گزرے اور مادی مائع کی ٹربائڈیٹی 0.45 سے گزر گئی۔ ام مائیکرو فلٹریشن میمبرین کیسٹ کے عمل سے نمایاں طور پر کم ہوا، جس سے یہ ظاہر ہوتا ہے کہ مائیکرو فلٹریشن میمبرین کیسٹ کے ساتھ ٹینجینٹل فلو فلٹریشن ٹیکنالوجی تیز رفتار سینٹری فیوج کے مقابلے میں بہتر تھی، اور ٹوٹے ہوئے ریکومبیننٹ ایسچریچیا کولی کے ناپاک پروٹین اور نیوکلک ایسڈ کو نمایاں طور پر کم کر سکتی ہے۔

 

واحد مائیکرو فلٹریشن میمبرین کیسٹ میں واضح مائع جمع کرنے کے بعد، 62.9% تھا جیسا کہ BL21-HP1036 کے ہدف پروٹین کا 37.1% مائکرو فلٹریشن کنسنٹریٹ تھا یا مائیکرو فلٹریشن میمبرین کیسٹ اور دیگر نقصانات میں موجود تھا۔ وضاحت کے لیے دو قدمی طریقہ اختیار کیا گیا۔ پہلے مرحلے میں، 0.45um مائیکرو فلٹریشن میمبرین کیسٹ کو واضح کرنے اور اخراج کو جمع کرنے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ دوسرے مرحلے میں، ٹیوب سینٹری فیوگریشن کے بعد بقیہ مرتکز مائع کو جمع کیا گیا، اور دو قدمی واضح مائع کو کرومیٹوگرافک نمونہ کے طور پر ملایا گیا BL21-palA ابال مائع کی ٹربائڈیٹی ویلیو میں نمایاں اضافہ نہیں ہوا، پروٹین کی پیداوار تک پہنچ سکتی ہے۔ 85.5% سے زیادہ، اور BL21-پالا فرمینٹیشن مائع کی پروٹین کی پیداوار دو قدمی علاج کے بعد 81.5% تک پہنچ سکتی ہے۔

 

جہاں تک مائیکرو فلٹریشن میمبرین کیسٹ کا انتخاب کیسے کیا جائے، گائیڈلنگ ٹیکنالوجی آپ کو اعلیٰ معیار کے حل فراہم کر سکتی ہے۔ ہماری مائیکرو فلٹریشن میمبرین کیسٹ اور الٹرا فلٹریشن میمبرین کیسٹ سیریز کی مصنوعات پولیتھر سلفون کو کیریئر کے طور پر استعمال کرتی ہیں، خاص طور پر بائیو ٹیکنالوجی کے لیے ڈیزائن کیا گیا ہے۔ ہمارے پولیتھر سلفون جھلی میں اعلی تھرو پٹ، کم پروٹین جذب، اعلی مکینیکل طاقت، اثر مزاحمت اور اسی طرح کے فوائد ہیں۔ ہم آپ کو ریئل ٹائم میں ان لیٹ اور آؤٹ لیٹ کے دباؤ کی پیمائش کرنے کے لیے خصوصی جھلی کے کلیمپ فراہم کرتے ہیں، اور آپ کے خصوصی الٹرا فلٹریشن/مائکرو فلٹریشن سسٹم کو اپنی مرضی کے مطابق بنانے کے لیے آپ کی ضروریات کے مطابق تکنیکی وزٹ فراہم کر سکتے ہیں۔ اس طرح کے چھوٹے ٹینجینٹل فلو سسٹم کو چھوٹے، پائلٹ اور چھوٹے پیمانے پر پیداوار کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے، اور آپ کے ٹیسٹ کی ضروریات اور پیداوار کی ضروریات کو مکمل طور پر پورا کرنے کے لیے مکمل طور پر لکیری امپلیفیکیشن ہو سکتا ہے۔

گائیڈلنگ کے بارے میں

گائیڈلنگ ٹیکنالوجی ایک قومی ہائی ٹیک انٹرپرائز ہے جو بائیو فارماسیوٹیکلز، سیل کلچر، بائیو میڈیسن کی تطہیر اور ارتکاز، تشخیص اور صنعتی سیالوں پر توجہ مرکوز کرتی ہے۔ ہم نے کامیابی کے ساتھ سینٹری فیوگل فلٹر ڈیوائسز، الٹرا فلٹریشن اور مائیکرو فلٹریشن کیسٹس، وائرس فلٹر، TFF سسٹم، ڈیپتھ فلٹر، ہولو فائبر وغیرہ تیار کیے ہیں۔ ہماری جھلیوں اور جھلیوں کے فلٹر بڑے پیمانے پر ارتکاز، نکالنے اور پری فلٹریشن، مائیکرو فلٹریشن، الٹرا فلٹریشن اور نینو فلٹریشن میں استعمال ہوتے ہیں۔ ہماری بہت سی پروڈکٹ لائنیں، چھوٹی، واحد استعمال کی لیبارٹری فلٹریشن سے لے کر پروڈکشن فلٹریشن سسٹم، سٹرلٹی ٹیسٹنگ، فرمینٹیشن، سیل کلچر اور مزید، جانچ اور پیداوار کی ضروریات کو پورا کرتی ہیں۔ گائیڈلنگ ٹیکنالوجی آپ کے ساتھ تعاون کرنے کے منتظر ہے!