جھلی ٹیکنالوجی اور ویکسین کی وضاحت (Ⅰ)

ویکسین مختلف ذرائع سے آتی ہیں، بشمول بافتوں کے نچوڑ، بیکٹیریل خلیات، وائرل ذرات، پروٹین اور نیوکلک ایسڈ جو ممالیہ کے دوبارہ پیدا ہونے والے خلیات، خمیر اور کیڑے کے خلیات سے تیار ہوتے ہیں۔

ویکسین کی تیاری کا سب سے عام طریقہ ابتدائی ابال کے عمل پر مبنی ہے جس کے بعد صاف کیا جاتا ہے۔ ویکسین کی تیاری ایک پیچیدہ عمل ہے جس میں بہت سے مختلف مراحل اور عمل شامل ہیں۔ مطلوبہ حتمی مصنوع کی پاکیزگی حاصل کرنے کے لیے درست صاف کرنے کے طریقہ کار کا انتخاب بہت ضروری ہے۔ ویکسین کی وضاحت ایک اہم قدم ہے جس کا پروڈکٹ کی بحالی اور اس کے نتیجے میں نیچے کی طرف صاف کرنے پر اہم اثر پڑتا ہے۔ ویکسین کو واضح کرنے کے لیے کئی تکنیکوں کا استعمال کیا جا سکتا ہے۔ جمع کرنے کے طریقہ کار اور آلات کا انتخاب بیٹری کی قسم، جمع کیے جانے والے پروڈکٹ کی نوعیت اور عمل کے مائع پر منحصر ہے۔ ان تکنیکوں میں جھلی کی فلٹریشن (مائکرو فلٹریشن، ٹینجینٹل فلو فلٹریشن)، سینٹرفیوگریشن، اور ڈیپ فلٹریشن (نارمل فلو فلٹریشن) شامل ہیں۔ ایک طویل تجربے سے، ویکسین کی کٹائی کی وضاحت عام طور پر سینٹرفیوگریشن کے بعد گہری فلٹریشن کے ذریعے حاصل کی جاتی ہے۔

 

حالیہ برسوں میں، جھلی پر مبنی تکنیکوں نے ویکسین کی وضاحت میں اہمیت حاصل کی ہے۔ اپ اسٹریم کے عمل تیزی سے ڈسپوزایبل ٹیکنالوجیز کا استعمال کر رہے ہیں، اس لیے کٹائی کی حکمت عملی کو تبدیل کرنا چاہیے۔ یہ مضمون مختلف جھلیوں پر مبنی ٹیکنالوجیز اور ویکسین کی وضاحت میں ان کے استعمال کا ایک جامع جائزہ فراہم کرتا ہے۔

 

01 تعارف

ویکسین متعدی بیماریوں کی روک تھام کا ایک اہم جزو ہیں، جو موت کی ایک چونکا دینے والی وجہ بنی ہوئی ہیں۔ امیونائزیشن کی بدولت ہر سال 2 سے 3 ملین کے درمیان لوگ خناق، تشنج، کالی کھانسی اور خسرہ سے بچ جاتے ہیں۔ ویکسین ایک وسیع رینج کا احاطہ کرتی ہیں، چھوٹے ریکومبیننٹ پروٹین سے لے کر پورے وائرس کے ذرات اور پورے بیکٹیریا تک۔ وہ مختلف نظاموں کے ذریعے تیار کیے جا سکتے ہیں: انڈے، ممالیہ کے خلیے، بیکٹیریا وغیرہ۔ ویکسین کی پیچیدگی اور تنوع کی وجہ سے، ویکسین پلیٹ فارمز میں بڑھتی ہوئی دلچسپی کے باوجود، فی الحال کوئی مین اسٹریم پیوریفیکیشن پروٹوکول یا ٹیمپلیٹ موجود نہیں ہے۔

 

عام طور پر، ایک ویکسین کے عمل کو تین حصوں میں تقسیم کیا جا سکتا ہے: اپ اسٹریم (پیداوار اور وضاحت)، بہاو علاج (تطہیر بشمول الٹرا فلٹریشن، کرومیٹوگرافی، اور کیمیکل ٹریٹمنٹ)، اور فارمولیشن (فائنل فل آپریشنز)۔ پیداواری نظام سے آزاد، وضاحت (غیر مطلوبہ مادوں کا ابتدائی اخراج) ایک مضبوط طہارت کے عمل کا تعین کرنے میں کلیدی کردار ادا کرتا ہے۔ ایک مناسب وضاحتی قدم بنیادی طور پر پورے خلیات، سیل ملبے، کولائیڈز، اور بڑے ایگریگیٹس کو ہٹاتا ہے تاکہ بہاو پروسیسنگ کے بوجھ کو کم کیا جا سکے۔ بعض صورتوں میں، وضاحت ناقابل حل نجاست، میزبان سیل پروٹین (HCP)، اور میزبان سیل نیوکلک ایسڈ کو بھی کم کر سکتی ہے۔ کسی بھی دوسرے طہارت کے مرحلے کی طرح، وضاحتی مرحلے کو ویکسین کی مخصوصیت اور پیداواری رکاوٹوں کے مطابق بناتے ہوئے زیادہ سے زیادہ مصنوعات کی پیداوار اور پاکیزگی حاصل کرنے کے لیے بہتر بنانے کی ضرورت ہے۔

 

ویکسین کی اقسام کے متفاوت ہونے کی وجہ سے، وضاحت کے لیے متعدد تکنیکوں کا استعمال کیا جاتا ہے، بشمول سینٹرفیوگریشن یا فلٹریشن (ٹیبل 1)۔

 

مطلوبہ وضاحت حاصل کرنے کے لیے عام طور پر آپریشنز کے کئی سلسلے درکار ہوتے ہیں۔ پہلا آپریشن بڑے ذرات (بنیادی وضاحت) کو ہٹانے کے لیے ڈیزائن کیا گیا ہے اور دوسرا آپریشن کولائیڈز اور دیگر ذیلی مائکرون ذرات (ثانوی وضاحت) کو ہٹانے کے لیے ڈیزائن کیا گیا ہے۔ کم رفتار سینٹرفیوگریشن ایک بار واضح کرنے والے آپشن کے طور پر کام کرتی ہے، جس سے سیل اور سیل ملبے کو بارش کے ذریعے ہٹایا جا سکتا ہے۔ سینٹرفیوگریشن زیادہ ٹھوس بوجھ کو سنبھال سکتی ہے اور اسے بیچ یا مسلسل موڈ اور ڈسک سینٹری فیوجز میں بڑے پیمانے پر استعمال کیا گیا ہے۔ اس کے لیے زیادہ سرمائے کی سرمایہ کاری اور دیکھ بھال کے اخراجات کی ضرورت ہوتی ہے، اور قابل اعتماد اسکیل ڈاون ماڈل کی کمی کی وجہ سے اسکیلنگ کو بڑھانے میں چیلنجوں کا سامنا ہے۔ تاہم، کچھ تجارتی ویکسین بنانے والے بڑے پیمانے پر پیداوار میں سینٹری فیوجز کا استعمال کرتے ہیں جس میں پروسیسنگ کی زیادہ مقدار اور زیادہ پیداواری سرگرمیاں شامل ہیں۔

 

وضاحتی فلٹریشن عام بہاؤ فلٹریشن (NFF، جسے ڈیڈ اینڈ فلٹریشن بھی کہا جاتا ہے) یا ٹینجینٹل فلو فلٹریشن (TFF، جسے کراس فلو فلٹریشن بھی کہا جاتا ہے) کے ذریعے انجام دیا جا سکتا ہے۔ مخصوص فلٹر موڈز (گہرے فلٹرز) بھی ہیں جن میں مثبت چارج شدہ مواد اور فلٹر ایڈز ہوتے ہیں جو سیل کے ملبے، کولائیڈز، اور منفی چارج شدہ ناپسندیدہ اجزاء کو برقرار رکھتے ہیں۔

 

جھلی کے فلٹرز سائز کے اخراج کے لحاظ سے ذرات کو برقرار رکھتے ہیں اور ان میں زیادہ گندگی برقرار رکھنے کی گنجائش نہیں ہوتی ہے، اس لیے وہ ثانوی وضاحتی مراحل کے لیے موزوں ہیں۔ گہرے فلٹرز اور میمبرین فلٹرز دونوں پیمانے اور لاگو کرنے میں آسان ہیں (سادہ سسٹم ڈیزائن)۔ NFF کے برعکس، TFF بنیادی طور پر بنیادی وضاحت (مائکرو فلٹریشن) کے لیے استعمال ہوتا ہے۔ 0 کی کٹ آف رینج والی جھلیوں کو۔ 65 μm (ترجیحا طور پر کھلے چینل کے ساتھ) خلیات، خلیے کے ملبے اور دیگر بڑے آلودگیوں کو برقرار رکھنے کے لیے کامیابی کے ساتھ استعمال کیے گئے ہیں۔ زیادہ تر TFF آلات لکیری طور پر توسیع پذیر اور صفائی کے بعد دوبارہ قابل استعمال ہوتے ہیں، جس سے قدم کے لیے استعمال کی جانے والی اشیاء کی قیمت میں نمایاں کمی واقع ہوتی ہے۔

 

وضاحتی مرحلہ اپ اسٹریم اور ڈاون اسٹریم کے عمل کے درمیان ہوتا ہے اور بعض اوقات ویکسین کے عمل کی نشوونما کے دوران اس کو نظر انداز کیا جاتا ہے کیونکہ صفائی کے دیگر مراحل جیسے کرومیٹوگرافی یا کثافت گریڈینٹ سینٹرفیوگریشن کے لیے وقت اور وسائل کو ترجیح دی جاتی ہے۔

 

یہاں تک کہ ویکسین کی تیاری کے عمل کے پیٹنٹ بھی اکثر وضاحتی مرحلے کو چھوڑ دیتے ہیں۔ واضح کرنے کی کارکردگی نیچے دھارے کے عمل کی کارکردگی کو براہ راست متاثر کرتی ہے۔ ایک ناقص اصلاحی اقدام جراثیم سے پاک فلٹر کی صلاحیت کو منفی طور پر متاثر کر سکتا ہے یا کرومیٹوگرافک رال کی سروس لائف کو کم کر سکتا ہے۔ آج، سخت ریگولیٹری توقعات ویکسین مینوفیکچررز کو خالص، اچھی خصوصیات والی لیکن سستی ویکسین تیار کرنے پر مجبور کرتی ہیں۔ اس معاملے میں، ہر قدم پر وہ توجہ دینے کی ضرورت ہے جس کا وہ مستحق ہے۔ موجودہ رجحانات بتاتے ہیں کہ اپ اسٹریم کا عمل ایک "کلینر" ایکسپریشن سسٹم کی طرف بڑھ رہا ہے (یعنی سیرم فری میڈیا میں کلچر شدہ خلیات انڈے کی جگہ لے لیتے ہیں) پیداواری صلاحیت اور زیادہ سیل کثافت کے ساتھ۔

 

حتمی مصنوع کی پاکیزگی کو بڑھانے کے لیے نیچے کی طرف صاف کرنے کے عمل کو آسان اور ہموار کیا جا رہا ہے۔ ان تبدیلیوں کو سنبھالنے کے لیے، وضاحت کا مرحلہ رکاوٹ نہیں بن سکتا۔ اس صورت میں، فلٹریشن ٹیکنالوجی ایک نئے وضاحتی چیلنج کو پورا کرتی ہے، جس میں عمل کی بڑھتی ہوئی لچک، واحد استعمال کے امکان، اور سرمایہ کاری کی لاگت میں کمی کے مسائل کو حل کیا جاتا ہے۔

 

02 وائرس کی ویکسین کی وضاحت

واضح کرنے کے کئی قسم کے طریقے، یا تو اکیلے یا مجموعہ میں، کامیابی سے ویکسین کے فیڈ اینڈ پر فصل کو واضح کرنے کے لیے استعمال کیے گئے ہیں۔

پائلٹ پیمانہ :1-20L، پیداوار کا پیمانہ: 20L سے زیادہ

 

2.1 وائرس ویکسین کی وضاحت کے لیے احتیاطی تدابیر

بہت سی ویکسین وائرس کے انفیکشن کے خلاف قوت مدافعت بنانے کے لیے وائرس کے تمام یا کچھ حصے پر مشتمل ہوتی ہیں۔ وہ عام طور پر چار وسیع زمروں میں آتے ہیں:

لائیو اٹینیویٹڈ ویکسین (LAV)، جو وائرس کے کمزور تناؤ پر مبنی ہے تاکہ اس کے وائرس کو کم کیا جا سکے۔ کمزور وائرس جسم میں نقل کر سکتے ہیں لیکن روگجنک نہیں ہیں۔

- غیر فعال وائرس (IV) ویکسین، جس میں انفیکشن کو ختم کرنے کے لیے کیمیکل یا الٹرا وائلٹ غیر فعال وائرس ہوتے ہیں۔ وائرس کے ذرات مکمل، تقسیم، یا صاف ہو سکتے ہیں (صرف اینٹی جینک پروٹین)۔

- وائرل ویکٹر (VV) ویکسین ایک فعال، غیر پیتھوجینک وائرس ہے جو پیتھوجینک وائرس کا اینٹیجن پیش کرتا ہے۔ یہ حال ہی میں تیار کردہ ڈھانچے کو جین تھراپی ایپلی کیشنز کے لیے بھی استعمال کیا جاتا ہے۔

وائرس نما ذرات (VLPs) ویکسین، وائرل سبونائٹ ویکسین کی ایک مخصوص کلاس جو وائرل ذرات کی مجموعی ساخت کی نقل کرتی ہے لیکن ان میں متعدی جینیاتی مواد نہیں ہوتا ہے۔

 

زیادہ تر معاملات میں، وائرل ذرات وضاحتی مرحلے کے دوران مکمل طور پر برقرار رہتے ہیں، یہاں تک کہ وائرل ویکسین کے لیسس کے دوران بھی (کلیویج عام طور پر نیچے کی طرف، زیادہ صاف ماحول میں کی جاتی ہے)۔

وائرل وضاحت کا بنیادی چیلنج سیل کے ملبے، بڑے مجموعوں اور ناقابل حل آلودگیوں کو مؤثر طریقے سے ہٹاتے ہوئے اعلی پیداوار والے وائرل ذرات کی بازیافت ہے۔ جیسا کہ مندرجہ ذیل حصوں میں بیان کیا گیا ہے، کئی عوامل ہیں جو وائرس کے انحطاط یا نقصان کا سبب بن سکتے ہیں۔ اس کے علاوہ، وائرس کی پیداوار پر انحصار کرنا مشکل ہو سکتا ہے کیونکہ عمل کے اس مرحلے پر وائرل مقداری پرکھ کے طریقوں کی اعلی تغیر پذیری، خاص طور پر LAV اور VV ویکسینز کے لیے۔ ان ویکسینز کے لیے، وائرل پیداوار کا اکثر انفیکشن ٹیسٹ جیسے پلاک ٹیسٹ یا TCID 50 ٹیسٹ کے ذریعے جائزہ لیا جاتا ہے۔ حقیقت یہ ہے کہ کٹے ہوئے مرکبات میں سے کچھ وائرس کی نشاندہی کرنے والے خلیوں کو متاثر کرنے کی صلاحیت میں مداخلت کر سکتے ہیں اس مقداری نقطہ نظر کی تغیر کو بڑھاتا ہے۔

 

2.2 وائرس ویکسین کی وضاحت کی حکمت عملی

وائرل ویکسین سائز، ساخت، شکل، اور اظہار کے نظام میں بہت مختلف ہوتی ہیں (ٹیبل 3)۔

نتیجے کے طور پر، اس کے بہاو کے عمل کے لیے عام طور پر کوئی ٹیمپلیٹ نہیں ہے، خاص طور پر وضاحتی اقدامات۔ نظریہ میں، تمام دستیاب تکنیکوں (کم رفتار سینٹرفیوگریشن، مائیکرو فلٹریشن TFF، NFF) کو منتخب کیا جا سکتا ہے اور ممکنہ طور پر وائرس کو واضح کرنے کے لیے جوڑا جا سکتا ہے۔ درحقیقت، وضاحت کے طریقوں کی کامیابی اظہار کے نظام اور اس میں شامل وائرس کی فزیکو کیمیکل خصوصیات سے متاثر ہوتی ہے۔

 

Recently, the high cell density process of viral vaccines is being explored. High cell density processes add to the challenge of clarification. Many treatment methods are by preconditioning, i.e. polymer-induced flocculation, precipitation, alternating TFF, etc. For example, Tomic et al. describe a method for high cell density collection (>{{0}} سیلز /ml) واضح کرنے کا طریقہ، cationic پولیمر کا استعمال کرتے ہوئے، روایتی طریقوں کے مقابلے میں گہرے فلٹریشن ایریا کو 4 گنا کم کر دیتا ہے۔ یہ تکنیک سنٹری فیوجز کے استعمال کے بغیر بڑی صلاحیت کے خمیر کی کٹائی کی اجازت دیتی ہے۔ اسی طرح، Riske et al. نے ظاہر کیا کہ 40 L سیل کلچرز (0.02%) کا چائٹوسن ٹریٹمنٹ جس میں 1۔{6}}.6% ٹھوس مواد گہری فلٹریشن کے بعد مکمل فلٹر کی صلاحیت میں 7-گنا اضافہ کا باعث بنے۔

 

انہوں نے یہ بھی ذکر کیا کہ چائٹوسن ذیلی مائکرون ذرات کو فلوکلیٹ کرکے وضاحت کی کارکردگی کو بہتر بناتا ہے، جو عام طور پر سینٹری فیوجز میں آباد ہوتے ہیں۔ پری ٹریٹمنٹ اور فلوکولیشن کے طریقے مستقبل میں ویکسین فلٹریشن کی وضاحتوں کا حصہ بنے رہنے کا امکان ہے۔ پینیٹرینٹ، بشمول شکر، گلائکول، اور امینو ایسڈ، ترجیحی طور پر وائرس کو فلوکلیٹ کرتے ہیں۔ آسموٹک محلول کے ساتھ وائرل فلوکولیشن جس کے بعد 0.2µ مائکرو فلٹریشن کو وائرس صاف کرنے کے لیے ایک جامع عمل کے طور پر استعمال کیا جا سکتا ہے۔ پینیٹرینٹس ہائیڈرو فوبک نان کیپسولیٹڈ وائرس پارٹیکلز اور انکیپسولیٹڈ وائرس پارٹیکلز کو فلوکلیٹ کرنے کے لیے ذرات کے گرد ہائیڈریشن پرت کو کم کرکے وائرل ایگریگیشن کو متحرک کر سکتے ہیں۔ اگرچہ دخول کرنے والوں کو وائرسوں کو فلوکلیٹ کرتے ہوئے دکھایا گیا ہے، لیکن یہ طریقہ مستقبل میں ویکسین کی صفائی کے لیے ایک پلیٹ فارم بننے کی صلاحیت رکھتا ہے، اور پائلٹ یا بڑے پیمانے پر ویکسین صاف کرنے میں اس کی فزیبلٹی ثابت نہیں ہوئی ہے۔ flocculation pretreatment طریقہ، جو مستقبل میں ویکسین فلٹر کی وضاحت کا حصہ بنے رہنے کا امکان ہے، 2L fermenter میں انجام دیا جاتا ہے۔ بڑے پیمانے پر پیداواری کارروائیوں میں ممکنہ طور پر استعمال ہونے کے لیے، ان طریقوں کو پائلٹ اور پیداواری پیمانے پر درست کرنے کی ضرورت ہے۔

 

2.2.1 نظام کے اثرات کا اظہار

وضاحت کا طریقہ بنیادی طور پر اپ اسٹریم کے عمل اور اظہار کے نظام کی قسم پر منحصر ہے، جو آلودگیوں کی قسم اور سطح کو ہٹانے کا تعین کرتا ہے۔ وائرل ویکسین عام طور پر چکن ایمبریو میں ممالیہ جانوروں یا پرندوں یا بیکولووائرس/کیڑے کے خلیوں کی مسلسل سیل لائنوں کے ذریعے تیار کی جاتی ہیں، جو کہ زیادہ پیچیدہ اظہار کا نظام ہے۔ کچھ قسم کے VLPs دوسرے ہیٹرولوگس ایکسپریشن سسٹم (بیکٹیریا، خمیر، پودوں کے خلیات) کے ذریعے بھی تیار کیے جا سکتے ہیں۔

 

2.2.1.1 چکن ایمبریو میں پیدا ہونے والا وائرس

کئی دہائیوں سے انڈوں میں ویکسین تیار کی جاتی رہی ہیں۔ یہ کام 1931 کا ہے، جب ووڈرف اور اچھی چراگاہ نے وائرس کی نشوونما کے لیے زرخیز انڈوں کی کوریو-ایلنٹوک جھلی کو کامیابی کے ساتھ استعمال کیا۔ آج بھی اس قدیم عمل کو استعمال کرتے ہوئے بہت سے انسانی اور ویٹرنری ویکسین تیار کی جاتی ہیں۔ سب سے زیادہ مشہور شاید موسمی فلو ویکسین ہے۔ اصول یہ ہے کہ مرغی کے انڈوں کو دلچسپی کے وائرس کے ساتھ ٹیکہ لگایا جائے اور پھر کوریو-ایلنٹوک جھلی میں نقل کیا جائے۔ پنروتپادن کے بعد، وائرل ذرات سے بھرپور allantoic سیال جمع اور پاک کیا جاتا ہے۔

 

Allantoic سیال ایک مشکل واضح کرنے والا فیڈ ہے۔ اس کا اعلیٰ معدنی اور پروٹین کا مواد (بشمول اوولبومین) اسے ایک اعلیٰ چپچپا پن دیتا ہے۔ Allantoic سیال میں چکن ایمبریو سے ضروری بافتوں کے مرکبات بھی ہوتے ہیں، جیسے پنکھ، چونچ، خون کی نالیاں، یا خون کے خلیات۔ اعلی ٹھوس مواد کی وجہ سے، کم رفتار سینٹرفیوگریشن بنیادی وضاحت کے لیے ترجیحی آپشن ہے، جس کے نتیجے میں عام طور پر ریکوری کی شرح تقریباً 70% ہوتی ہے۔ تاہم، فلٹریشن تکنیک کا استعمال کرتے ہوئے بنیادی وضاحت بھی ممکن ہے۔ این ایف ایف کے لیے، پولی پروپیلین اور سیلولوز پر مبنی گہرے فلٹرز میں ایلنٹوک سیال جمع کرنے کی اچھی صلاحیتیں ہیں۔ پولی پروپیلین یا سیلولوز پر مبنی گہرے فلٹرز سے بنائے گئے سطح کے فلٹرز میں 150-210 L/m² کی گنجائش ہو سکتی ہے اور فیڈ فلو ٹربائڈیٹی کو 3 گنا تک کم کر سکتے ہیں۔ کھلا فیڈ چینل TFF ڈیوائس بھی allantoic سیال کی وضاحت کے لیے موزوں ہے، کیونکہ ڈیوائس فیڈ چینل کے ذریعے کم سے کم دباؤ کے نقصان کے لیے زیادہ موزوں ہے، اس طرح چینل کی رکاوٹ کو کم کرتا ہے۔

 

ثانوی وضاحت کا مرحلہ آسانی سے NFF کے ساتھ کیا جا سکتا ہے۔ پولی پروپیلین، سیلولوز اور گلاس فائبر مواد کا امتزاج عام طور پر اچھی کارکردگی دکھاتا ہے، اور ثانوی وضاحتی مرحلے کا متبادل TFF اور {{0}}.65μm یا 0.45μm مائکرو فلٹریشن میمبرین ڈیوائس کا استعمال کرنا ہے اور اوسموٹک فلوکس کو چلانا ہے۔ کنٹرول اس مرحلے میں ہائیڈرو فیلک PVDF یا ہائیڈرو فیلک PES جھلی کے ساتھ ایک کھلا چینل TFF آلہ استعمال کیا جا سکتا ہے۔

یہ نوٹ کرنا ضروری ہے کہ وائرل ذرات ناقابل حل ملبے والے مواد سے منسلک ہو سکتے ہیں، جو وضاحت کے دوران وائرل کی پیداوار کو نمایاں طور پر کم کر سکتے ہیں۔ نمک کے محلول کا استعمال انفلوئنزا وائرس اور ٹھوس ٹکڑوں کے درمیان اس تعلق کو کم کر سکتا ہے، جس کے نتیجے میں وائرل ذرات کی سالمیت کو متاثر کیے بغیر پیداوار میں تقریباً دو گنا اضافہ ہوتا ہے۔

 

2.2.1.2 پے درپے ممالیہ اور ایویئن سیل لائنوں میں پیدا ہونے والے وائرس

حال ہی میں، کچھ وائرل ویکسین سیل کلچر پر مبنی عمل (خاص طور پر انفلوئنزا ویکسین کے لیے) کے حق میں انڈے پر مبنی عمل سے ہٹ گئی ہیں۔ اس سوئچ کی بنیادی وجہ جنین کے انڈوں سے وابستہ ویکسین کی تیاری کے مسائل کو روکنا ہے (یعنی انڈوں کی فراہمی کی کمی جو کہ پولٹری کی بیماری کے پھیلنے کی صورت میں ہو سکتی ہے)۔ نتیجے کے طور پر، کئی قسم کی ویکسین اور وائرل ویکٹر فی الحال ممالیہ جانوروں یا پرندوں کی مسلسل سیل لائنوں، روایتی سیل لائنوں (جیسے ویرو، MDCK، یا HEK293 سیل لائنز)، یا ملکیتی سیل لائنوں کا استعمال کرتے ہوئے تیار کیے گئے ہیں۔

 

ایکسپریشن سسٹم پر منحصر ہے، وائرس سیل کے اندر رہ سکتا ہے، جس کے لیے سیل لیسز مرحلہ درکار ہوتا ہے، یا یہ سیل سے باہر رہ سکتا ہے (لیسس یا بڈنگ)۔ سیل کلچر سے حاصل ہونے والا ٹھوس بوجھ اور گھلنشیل مواد allantoic مائع مرحلے سے کہیں زیادہ صاف ہوتا ہے۔ نتیجے کے طور پر، NFF ٹیکنالوجی کو لاگو کرنا آسان ہے اور صلاحیت نمایاں طور پر زیادہ ہے. تاہم، فلٹریشن کی صلاحیت سیل کلچر کے حالات پر بہت زیادہ انحصار کرتی ہے، جیسے سیل کی کثافت یا کٹائی کے وقت سیل کی قابل عمل۔ یہ پیرامیٹرز سیل کے ملبے اور میکرو ایگریگیٹس کی مقدار کو متاثر کرتے ہیں جو گہرے فلٹرز اور جھلیوں کو روک سکتے ہیں، جس کے نتیجے میں صلاحیت کم ہوتی ہے۔

 

Thomassen et al NFF وضاحت کی ایک اچھی مثال پیش کرتے ہیں۔ غیر فعال پولیو وائرس (IPV) کی پیداوار کے عمل میں استعمال کیا جاتا ہے۔ مائیکرو کیرئیر پر کلچر کیے گئے ویرو سیلز کو وائرل پھیلاؤ کے لیے استعمال کیا گیا جس کی سیل کثافت {{0}.78 x 106 سیلز /ml TOI ہے۔ ایک 75μm سٹینلیس سٹیل کی سکرین کا استعمال پیشگی وضاحت کے لیے کیا جاتا ہے تاکہ مائیکرو کیرئیر کو فصل سے ہٹایا جا سکے۔ ڈبل پرت کی درجہ بندی کو کثافت والے گہرے فلٹر (02-2.0μm) کا استعمال کرتے ہوئے واضح کیا جاتا ہے، اس کے بعد ایک جراثیم سے پاک گریڈ فلٹر ہوتا ہے۔

منتخب توسیع پذیر ڈسپوزایبل یونٹ کو 350 L پیمانے پر سبین آئی پی وی کلینیکل ٹرائل میٹریل کی تیاری کے لیے کامیابی کے ساتھ استعمال کیا گیا۔ وائرس سیروٹائپ پر منحصر ہے، وائرس کی بحالی کی شرح 86 سے 96 فیصد تک حاصل کی جاتی ہے۔

 

2.2.1.3 کیڑوں کے خلیوں کے نظام میں پیدا ہونے والے بیکولو وائرس/وائرس جیسے ذرات

بڑے پیمانے پر ویکسین کی تیاری کے لیے بیکولووائرس/کیڑے کے خلیوں کے نظام پر غور کرنا نسبتاً نیا ہے، لیکن وائرل ویکٹرز اور VLPs کے شعبے میں بڑھتی ہوئی دلچسپی کو اپنی طرف متوجہ کر رہا ہے۔ اس نظام کا بنیادی فائدہ یہ ہے کہ اس میں قلیل المدتی (سیل لائنیں قائم کرنے کی ضرورت نہیں) اور محفوظ (کوئی مکمل وائرل ڈی این اے نہیں) کی پیداوار شامل ہے۔ کچھ نقصانات بھی ہیں، جیسے بیکولو وائرس کو ہٹانے کی ضرورت اور مصنوعات کی استحکام۔

 

Cervarix، GlaxoSmithKline کے ذریعہ تیار کردہ انسانی پیپیلوما وائرس کے انفیکشن کے خلاف ایک VLP ویکسین، تجارتی طور پر کیڑوں کے خلیوں میں تیار کی جانے والی پہلی انسانی ویکسین ہے۔ بیکولووائرس سے متاثرہ کیڑے کے خلیوں میں تیار کردہ VLPs اور rAAV ویکٹر پر مبنی متعدد ویکسین اس وقت ترقی کے مراحل میں ہیں۔ خزاں کے آرمی ورم Spodoptera Frugiperda (Sf9 اور Sf21) اور گوبھی کے موڑنے والے کیڑے Trichoplusia ni (BTI-TN5B1-4 خلیات) سے حاصل کردہ کیڑے سیل لائنیں سب سے زیادہ استعمال ہوتی ہیں کیونکہ ان کی سسپنشن میں بڑھنے کی صلاحیت ہوتی ہے، جو اپ اسٹریم کو آسان بناتی ہے۔ عمل زندہ خلیوں کی مطلوبہ کثافت تک بڑھنے کے بعد، یہ خلیے پروٹین کے اظہار کے لیے خلیے کی افزائش کے ایکسپونینشل مرحلے میں ریکومبیننٹ بیکولو وائرس سے متاثر ہوتے ہیں۔ بیکولو وائرس کا بڑا جینوم پانچ یا زیادہ مختلف پروٹینوں کے اظہار کی اجازت دیتا ہے، جو VLP اور وائرل ویکٹر کی پیچیدگی سے میل کھاتا ہے۔

 

برنارڈ وغیرہ۔ کیڑے کے خلیوں کی ثقافت کے بہاو کے عمل کو بیان کیا۔ یہ عمل انتہائی متغیر ہے، جو اس تکنیک سے پیدا ہونے والے پروٹین کے تنوع کو ظاہر کرتا ہے۔ طہارت کی ترتیب کا پہلا مرحلہ بائیو ری ایکٹر کی حجم کی خصوصیات (یعنی خلیے کی کثافت اور قابل عملیت) یا مصنوعات کے اجراء کی نوعیت سے بہت زیادہ متاثر ہوتا ہے (بڈنگ یا سیل لیسز کے ذریعے خفیہ ہوتا ہے)۔ کیڑے کے خلیوں کا بیکولووائرس انفیکشن 3-5 دنوں کے اندر سیل لیسز کا سبب بن سکتا ہے۔ خلیات کی تباہی پروٹولیٹک سرگرمی اور دیگر ماحولیاتی عوامل میں اضافے کا باعث بن سکتی ہے جو کہ دوبارہ پیدا ہونے والے پروٹین کے انحطاط کا باعث بن سکتے ہیں۔

سیل لیسز شروع کرنے کی کم صلاحیت کے ساتھ بیکولو وائرس تیار کرنے کی کوششیں کی گئی ہیں۔ بیکولووائرس 10 فیصد سے کم متاثرہ کیڑوں کو ختم کرتا ہے۔

 

سیل لیسز مختلف طریقوں کا استعمال کرتے ہوئے انجام دیا جا سکتا ہے، جیسے منجمد پگھلاؤ، ڈٹرجنٹ، ہوموجنائزر، یا الٹراساؤنڈ علاج۔ کیڑے کے خلیوں میں سیل کی دیوار نہیں ہوتی ہے اور اس وجہ سے وہ جلدی گھل جاتے ہیں۔ اگرچہ الٹراسونک علاج بہت سے بینچ کے عمل میں رپورٹ کیا گیا ہے، یہ شاذ و نادر ہی تجرباتی یا تجارتی پیمانے پر استعمال کیا جاتا ہے. سب سے عام طریقہ یہ ہے کہ کم ارتکاز والے صابن (0.1% Triton X-100 یا NP-40) کی موجودگی میں خلیات کو تباہ کرنے کے لیے homogenizer کا استعمال کریں۔ ڈٹرجنٹ کا استعمال اور مائیکرو فلائیڈائزیشن یا آسموٹک امپیکٹ ہوموجنائزیشن کو بہت سے بڑے پیمانے پر مینوفیکچرنگ کے عمل میں کامیابی کے ساتھ استعمال کیا گیا ہے۔ عام طور پر، کیڑے کے خلیے lysis بفرز (50 mM TRIS pH7.7، 300 mM NaCl، 5% glycerol، 0.2 mM PMSF، اور پروٹیز روکنے والے) میں معطل ہوتے ہیں، جس کے دوران Triton-X100 0.1% کی حتمی حراستی میں شامل کیا جاتا ہے، اس کے بعد ہلکا الٹراساؤنڈ یا مائیکرو فلائیڈائزیشن ہوتا ہے۔ اس کے بعد مرکب کو غیر حل پذیر ذرات کو دور کرنے کے لیے سینٹرفیوج کیا جاتا ہے۔

 

اس مرحلے پر، lysate بہت ابر آلود دکھائی دے سکتا ہے اور اسے 0.45μm فلٹر کا استعمال کرتے ہوئے فلٹر کرنا مشکل ہے۔ بعض اوقات pyrolysis وضاحت کے مرحلے کے دوران 30% تک کے نقصانات کا مشاہدہ کیا جا سکتا ہے۔ کلیویج مرحلے پر بینزوینزائمز کا اضافہ فلٹریشن کے مسئلے کو حل کرنے میں مدد کرتا ہے۔ کٹائی کے بعد فاسفیٹ بفرڈ نمکین پانی کے ساتھ خلیوں کی صفائی اور تیز نمک (500mM NaCl) میں تیزی سے "فریز تھرو" کرنا جس میں کریکنگ بفر ہوتا ہے ان کو ہٹانے میں مدد کرتا ہے۔

 

کیڑے کے خلیوں کے ذریعہ تیار کردہ VLPs اور وائرل ویکٹرز کی وضاحت سیل لیسز (کیمیائی یا مکینیکل علاج کے ذریعہ) کے بعد ہوتی ہے، جو نہ صرف وائرل ذرات بلکہ سیلولر نیوکلک ایسڈ کی بڑی مقدار کو بھی خارج کرتی ہے۔ کیڑے کے خلیے زیادہ خلیے کی کثافت پر بڑھنے کے قابل ہوتے ہیں، 1-9 سے۔{1}} خلیات/ملی۔ لہٰذا، وضاحتی مرحلے میں خلیے کی اعلی کثافت، اعلیٰ نیوکلک ایسڈ مواد اور، اگر ممکن ہو تو، بیکولووائرس کے ذرات کو ہٹانے سے نمٹنا چاہیے۔ معاملات کو مزید پیچیدہ بنانے کے لیے، VLPs یا وائرل ویکٹر اور بیکولووائرس ایک جیسے سائز کے ہو سکتے ہیں (بیکولو وائرس 60-80 نینو میٹر چوڑے اور 300-400 نینو میٹر لمبے ہوتے ہیں)۔ اعلی سیل کثافت کی وجہ سے، سینٹرفیوگریشن دہائیوں سے بنیادی وضاحت کے لیے ترجیحی تکنیک رہی ہے۔ تاہم، جھلی کے عمل ایک بہت پرکشش متبادل معلوم ہوتے ہیں کیونکہ اسکیل ایبلٹی کی وضاحت کرنا آسان ہے۔

 

تین پرتوں والے روٹا وائرس جیسے ذرات کے بہاو کے عمل میں گہرے فلٹرز کو مؤثر طریقے سے استعمال کیا گیا ہے۔ لیبارٹری کی سطح پر، CsCl کثافت گریڈینٹ الٹرا سینٹرفیوگیشن طریقہ اکثر ان پیچیدہ ذرات کو پاک کرنے کے لیے استعمال کیا جاتا ہے۔ محققین نے نہ صرف گہرے فلٹر کے وضاحتی مرحلے کا، بلکہ پورے بہاو کے عمل کا بھی جائزہ لیا (ٹرائٹن X-100 کلیویج اور گہری فلٹریشن، جس کے بعد الٹرا فلٹریشن اور پارٹیکل سائز کا اخراج)۔ نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ CsCl کثافت میلان کی پیداوار 37% تک پہنچ سکتی ہے۔

الٹرا سینٹرفیوگل طریقہ تقریباً 10% ہے۔ ایک اور مثال کے طور پر، 0.45μm کھوکھلے ریشے اور 500 kDa باریک قطر کے ریشوں کو کیڑوں کے خلیوں میں پیدا ہونے والے HIV جیسے ذرات کی بازیافت اور توجہ مرکوز کرنے کے لیے استعمال کیا گیا۔ اس مطالعے میں، خلیے کی سالمیت کی بنیاد پر کھوکھلی ریشوں کی قینچ قوت کو بہتر بنایا گیا تھا۔ نتائج ٹیبل شوگر گریڈینٹ الٹرا سینٹرفیوگریشن کو تبدیل کرنے کے لیے کم شیئر فورس کا عمل قائم کیا گیا تھا۔

 

اس عمل میں بڑے پیمانے پر پیداوار پر لاگو ہونے کی صلاحیت ہے۔ ڈیپ فلٹرز کو دوبارہ پیدا کرنے والے اڈینو سے وابستہ وائرس کی تیاری میں بھی کامیابی کے ساتھ استعمال کیا گیا ہے۔ سیل لیسز دو پسٹن مکینیکل سیل جیمر کے ساتھ انجام دیا گیا تھا، اس کے بعد نیوکلیز علاج کیا گیا تھا۔ وضاحت کے مرحلے میں، 1.2μm گلاس فائبر ڈیپ فلٹر عنصر استعمال کیا گیا، اس کے بعد 0.8μm ہائیڈرو فیلک PES اور 0.2μm ہائیڈرو فیلک PES کی دو پرتیں تھیں۔ متناسب سائز کے فلٹرز چھوٹے سے 200 L سائز تک پروسیس بیچز کے لیے استعمال کیے جاتے ہیں۔ گہرے فلٹرز کو کامیابی کے ساتھ استعمال کیا گیا ہے، اور فلیٹ فلموں یا 0.2µm یا 0.45µm کے کھوکھلے ریشوں کے ساتھ TFF کی درجہ بندی بھی بہت مؤثر بتائی گئی ہے۔

 

پرتگال میں Oeiras Institute of Experimental Biology میں Tecnologica (IBET) کے مطالعے میں NFF کا استعمال ہیپاٹائٹس C VLP کی وضاحت کرنے کے لیے کیا گیا جس کا اظہار بیکولو وائرسز کے ذریعے سینٹرفیوگریشن کے بغیر کیا گیا۔ VLP کٹائی کو واضح کرنے کے لیے برائے نام درجہ بندی والے پولی پروپیلین فلٹرز (10,5,0.6 اور 0.3μm) فلٹرز استعمال کیے جاتے ہیں۔ VLP کٹائی کے مراکز میں فلٹریشن کے لیے 0.6μm اور 0.3μm pore ریٹنگ والے وہی فلٹرز استعمال کیے جاتے ہیں۔ مطالعہ کیے گئے تمام فلٹریٹس کا HCV-VLP ریکوری ریٹ کے لیے تجربہ کیا گیا اور فلٹریشن کے تجویز کردہ طریقوں کا موازنہ کیا گیا۔ نتائج ٹیبل 4 میں دکھائے گئے ہیں۔

نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ 5μm-0.3μm فلٹر میں ہیپاٹائٹس C VLP فیڈ کی براہ راست کٹائی کے لیے سب سے زیادہ پروڈکٹ ریکوری (100%) تھی۔ پولی پروپلین 0.6μm فلٹر میں مرکزی فیڈ کے لیے سب سے زیادہ پروڈکٹ ریکوری (82%) تھی، اور میزبان سیل کی DNA کلیئرنس تقریباً 70% تھی۔

 

2.2.1.4 بیکٹیریا یا خمیر کے نظام میں پیدا ہونے والے وائرس جیسے ذرات

VLP ویکسین کے لیے وضاحتی طریقہ کار کی قسم جو بیکٹیریل یا یسٹ سسٹمز میں ظاہر ہوتی ہے اس کا انحصار ماورائے خلوی ثالثوں کو VLP کی رہائی پر ہوتا ہے۔ اگر VLPs کو مؤثر طریقے سے خفیہ نہیں کیا جا سکتا ہے تو، اصل وضاحت کے مرحلے سے پہلے سیل لیسز یا دیگر نکالنے کے اقدامات کی ضرورت پڑ سکتی ہے۔ اگرچہ یہ پروٹین کی وضاحت کی صنعت میں سونے کا معیار ہے، بیکٹیریل یا خمیر پر مبنی نظاموں میں بیان کردہ سینٹرفیوگریشن (مسلسل یا بیچ)، حال ہی میں، جھلی کے عمل ایک بہت پرکشش متبادل بن گئے ہیں کیونکہ ان کی توسیع پذیری کی آسانی اور سنگل استعمال کے ساتھ مطابقت ہے۔ علاج

 

ریکٹر اور ٹوپیل واضح E. coli میں تیار کردہ VLPs تیار کرتے وقت سینٹرفیوگریشن، TFF، یا دونوں کے مجموعے کے استعمال کی وضاحت کرتے ہیں۔ ان کے کام میں، 0.45m TFF جھلیوں کو 5 ڈگری کے درجہ حرارت پر ہم جنس ای کولی ہوموجینیٹس کو پتلا اور واضح کرنے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ انہوں نے یہ بھی نوٹ کیا کہ جھلی پر مبنی TFF اعلی viscosity فصلوں کو سنبھالنے کے لئے موزوں ہے، ترجیحا TFF یونٹس کو کھلے چینل کنفیگریشن کے ساتھ استعمال کرنا۔

TFF کے متبادل کے طور پر سینٹرفیوگل وضاحت کا بھی جائزہ لیا گیا ہے۔ اس صورت میں، نتیجے میں پیدا ہونے والے ہوموجنیٹ کو 105 منٹ، 10000g کے لیے 4 ڈگری پر پتلا اور سینٹرفیوج نہیں کیا گیا تھا۔ نرم کوٹنگ کو منتقل کیے بغیر، سپرنٹنٹ کو ذرات سے باہر ڈالا گیا اور 60 منٹ کے لیے 4 ڈگری اور 10,000 جی پر دوبارہ سینٹرفیوج کیا گیا۔ اس کے بعد سپرنٹنٹ کو موجودہ ذرات سے ہٹا دیا گیا، EB بفر (43.89 mM Tris HCl، 6.11 mM Tris Base، 5.0 mM EDTA، 10% (v/v) Triton X-100) 1:2 سے پتلا کیا گیا، اور فلٹر کیا گیا۔ 0.22 میٹر جراثیم سے پاک فلٹر ڈیوائس پر۔ مزید پروسیسنگ۔ 800L پیمانے پر E. coli میں اس VLP ویکسین کی تیاری کے لیے اسکیل اپ کے عمل کو بھی مبینہ طور پر سینٹرفیوگریشن اور TFF کے امتزاج سے واضح کیا گیا تھا۔

 

ریکومبیننٹ ہیپاٹائٹس ای ویکسین HEV 239 کو چین میں 16 سال یا اس سے زیادہ عمر کے بالغوں کو حفاظتی ٹیکے لگانے کے لیے لائسنس دیا گیا ہے۔ ویکسین اینٹیجنز (VLP) کو E. coli میں ظاہر کیا جاتا ہے، اور اینٹیجن کی پیداوار کے عمل کے پیمانے پر 50L پیمانے پر ہونے کا مظاہرہ کیا گیا ہے۔ پروڈکٹ کو ای کولی کو کریک کرکے نکالا گیا تھا اور انکلوژن باڈیز کو سیل کے ٹکڑوں سے 2% Triton X-100 پر مشتمل بفر کے ساتھ بھاری دھونے کے ذریعے الگ کیا گیا تھا اور پھر 4 M یوریا ہوموجنائزر کے ساتھ تحلیل کیا گیا تھا۔ TFF Saccharomyces cerevisiae (15L) میں پیدا ہونے والے انسانی پیپیلوما وائرس VLP کو واضح کرتا ہے۔ نیوکلیز کے ساتھ علاج شدہ سیل لائسیٹ کو 0.65 μm کھوکھلی فائبر فلٹر کا استعمال کرتے ہوئے ٹرانسفلٹریشن موڈ میں کراس فلو مائکرو فلٹریشن کے ذریعہ واضح کیا گیا تھا۔ ویکسین کی تیاری میں بھی یہی عمل استعمال ہوتا ہے۔ اگرچہ صرف مٹھی بھر VLP پر مبنی ویکسین تجارتی پیمانے پر پہنچی ہیں، کئی VLP پر مبنی ویکسین تیار ہو رہی ہیں، جن میں سے زیادہ تر کو سینٹرفیوگریشن یا میمبرین ٹیکنالوجی کے ذریعے واضح کیا جاتا ہے۔

 

خلا کے اثر و رسوخ سے محدود، ہم اگلے باب میں مواد کا دوسرا حصہ شیئر کریں گے۔ اگلے مضمون میں، ہم ویکسین کی وضاحت اور متعلقہ جھلی کے اجزاء کے استعمال کے کچھ کیسز کا اشتراک کریں گے۔

 

لوکلائزیشن سرکٹ میں پہلی کمپنی کے طور پر، گائیڈلنگ ٹیکنالوجی نے ویکسین کی وضاحت میں کافی متعلقہ تجربہ جمع کیا ہے۔ گائیڈلنگ ٹیکنالوجی ایک ترقی اور پیداواری کمپنی ہے جو بائیو فارماسیوٹیکل اور سیل کلچر، پیوریفیکیشن اور علیحدگی پر توجہ مرکوز کرتی ہے۔ مصنوعات بڑے پیمانے پر بائیو میڈیسن، تشخیص، صنعتی سیال فلٹریشن، پتہ لگانے، وضاحت، صاف کرنے اور ارتکاز کے عمل میں استعمال ہوتی ہیں۔ گائیڈلنگ نے کامیابی کے ساتھ الٹرا فلٹریشن سنٹری فیوج ٹیوب، الٹرا فلٹریشن/مائکرو فلٹریشن میمبرین کیسٹ، وائرس ہٹانے والا فلٹر، ٹینجینٹل فلو فلٹر ڈیوائس، ڈیپ میمبرین اسٹیک، وغیرہ کو کامیابی سے تیار کیا ہے، جو بائیو فارماسیوٹیکل اور سیل کلچر کے اطلاق کے منظرناموں کو پوری طرح پورا کرتے ہیں۔

 

ہماری جھلیوں اور جھلیوں کے فلٹر بڑے پیمانے پر ارتکاز، نکالنے اور پری فلٹریشن، مائیکرو فلٹریشن، الٹرا فلٹریشن اور نینو فلٹریشن میں استعمال ہوتے ہیں۔ ہماری پروڈکٹ لائنوں کی وسیع رینج، چھوٹے سنگل یوز لیبارٹری فلٹریشن سے لے کر پروڈکشن قسم کے فلٹریشن سسٹم، سٹرلٹی ٹیسٹنگ، فرمینٹیشن، سیل کلچر اور بہت کچھ، ٹیسٹنگ اور پروڈکشن کی ضروریات کو پورا کر سکتی ہے۔