ادب کا حصہ|پیچیدہ طہارت کو الوداع کہو؟ ایک ناول ٹی ایف ایف + سرفیکٹینٹ طریقہ کار کارکردگی کو بہتر بناتا ہے اور اے اے وی ویکٹر کی تیاری میں اخراجات کو کم کرتا ہے

جین تھراپی تیزی سے ترقی کر رہی ہے ، پھر بھی اس کی اعلی قیمت مریضوں تک وسیع تر رسائی کو روکنے میں ایک بڑی رکاوٹ بنی ہوئی ہے۔ اس لاگت کے کلیدی ڈرائیوروں میں ایڈینو - وابستہ وائرس (AAV) ویکٹر کی پیچیدہ پیداوار کا عمل ہے۔ بائیوٹیکنالوجی اور بائیو انجینئرنگ میں شائع ہونے والی ایک تحقیق میں سرفیکٹنٹس کے ساتھ ٹینجینٹل فلو فلٹریشن (ٹی ایف ایف) کو جوڑنے والے ایک ناول طہارت کا طریقہ تیار کیا گیا ہے ، جو AAV طہارت کے عمل کو آسان بنانے اور اخراجات کو کم کرنے کا وعدہ کرتا ہے۔ آئیے اس تحقیق کو تلاش کریں جس کی سربراہی یونیورسٹی آف ٹوکیو کی ایک ٹیم ہے۔

 

1. تحقیق کا پس منظر: AAV طہارت کی چیلنجز اور موجودہ حیثیت

AAV ویکٹر جین تھراپی میں ان کی اعلی حفاظت ، کم امیونوجنکیٹی ، تقسیم اور غیر - تقسیم کرنے والے خلیوں کو متاثر کرنے کی صلاحیت ، اور طویل - اصطلاح جین اظہار کی صلاحیت کی وجہ سے جین تھراپی میں "اسٹار" ڈلیوری ٹولز بن چکے ہیں۔ تاہم ، ان کی پیداوار کا عمل پیچیدہ ہے ، خاص طور پر بہاو صاف کرنے والے اقدامات ، جس میں عام طور پر سنٹرفیوگریشن اور کرومیٹوگرافی کے متعدد راؤنڈ شامل ہوتے ہیں۔ یہ طریقے وقت - استعمال ، مزدوری - انتہائی ، پیمانے پر مشکل اور مہنگا ہیں۔

لیبارٹری اسکیل پر ، طہارت اکثر سیزیم کلورائد یا آئوڈکسانول کثافت میلان الٹراسینٹری فوگشن پر انحصار کرتا ہے ، جو صنعتی پیداوار کے لئے پیمانے کے لئے چیلنج ہے۔ وابستگی کرومیٹوگرافی میں تیزی سے استعمال ہوتا ہے ، لیکن اس کی ضرورت کم پی ایچ پی ایلیشن کی شرائط وائرل انفیکشن کو خراب کرسکتی ہیں۔ لہذا ، ایک سادہ ، موثر ، نرم اور توسیع پذیر AAV طہارت کا طریقہ تیار کرنا ضروری ہے۔

ٹینجینٹل فلو فلٹریشن (ٹی ایف ایف) ایک سائز - پر مبنی علیحدگی کی تکنیک ہے جو عام طور پر بائیو پروڈکٹ کا تبادلہ اور بفر - کے لئے استعمال کی جاتی ہے۔ تاہم ، روایتی ٹی ایف ایف میں AAV طہارت کے دوران میزبان سیل پروٹین (HCPs) اور DNA جیسے نجاستوں کو دور کرنے کی محدود صلاحیت ہے ، جس میں اکثر پروٹین کی مجموعی کو پیچھے چھوڑ دیا جاتا ہے۔

 

2. جدید نقطہ نظر: موثر طہارت کے لئے سرفیکٹنٹ کے ساتھ مل کر ٹی ایف ایف

روایتی ٹی ایف ایف کی حدود پر قابو پانے کے لئے ، محققین رمی میاوکا ، یوجی سونکاوا ، اور یونیورسٹی آف ٹوکیو کے ساتھیوں نے ایک چالاک حکمت عملی وضع کی: سرفیکٹینٹس کو استعمال کرتے ہوئے ناپاک پروٹینوں کی اجتماعی اور باہمی رابطوں کو روکنے کے لئے ، جب وہ ٹی ایف ایف الٹرا فیلٹریشن جھلی (500 کے ڈی اے ملاپ) سے گزرنے کی اجازت دیتے ہیں۔ سائز میں NM)۔

انہوں نے تین قسم کے سرفیکٹنٹ کا تجربہ کیا:

• غیر - آئونک:آکٹیل گلوکوسائڈ
• anionic:سوڈیم ڈوکسائکولیٹ
• Zwitterionic:چیپس

اس تحقیق میں پتا چلا ہے کہ تنہا غیر {{0} ion آئنک سرفیکٹنٹ کا استعمال غیر موثر تھا۔ دونوں اینیونک سوڈیم ڈوکسائکلیٹ اور زو وٹیرونک چیپس نے بقایا پروٹینوں کو ہٹانے میں نمایاں اضافہ کیا ، اور انہوں نے مختلف پروٹین کی آبادی کو نشانہ بنایا۔ بالآخر ، 0.5 ٪ سوڈیم ڈوکسائکلیٹ کو 1 ٪ چیپس کے ساتھ جوڑ کر قابل ذکر نتائج برآمد ہوئے ، جس سے تقریبا completely مکمل طور پر بقایا میزبان پروٹین کو ختم کیا گیا۔ ایس ڈی ایس - صفحہ تجزیہ میں صرف تین واضح AAV کیپسڈ پروٹین بینڈ (VP1/VP2/VP3) دکھایا گیا ہے۔

 

چترا 1۔ سرفیکٹنٹ کے بغیر ٹی ایف ایف صاف کرنے کا عمل ؛(a) ایس ڈی ایس - صفحہ جیل الیکٹروفورسس ؛ (b) ٹرانسمیشن الیکٹران مائکروسکوپی (TEM)

 

چترا 1۔ سرفیکٹنٹس کے ساتھ ٹی ایف ایف طہارت کا عمل ؛(a) SDS - صفحہ جیل الیکٹروفورسس ؛ (b) ٹرانسمیشن الیکٹران مائکروسکوپی (TEM)

 

3. تحقیق کے نتائج: اعلی طہارت ، سرگرمی اور حفاظت

1. موثر نجاست کو ختم کرنا:نئے طریقہ کار نے ایچ سی پی کو 99.98 ٪ اور ڈی این اے کو 95 ٪ ہٹانا حاصل کیا ، جس میں طہارت کا موازنہ یا اس سے زیادہ ہے جس سے وابستہ کرومیٹوگرافی سے زیادہ ہے۔
2. بہتر انفیکشن:وٹرو کے تجربات میں یہ ظاہر ہوا کہ AAV1 ویکٹرز نے اس طریقہ کار سے متاثرہ HEK293 خلیوں کو زیادہ موثر انداز میں صاف کیا ہے جو وابستگی کرومیٹوگرافی (24.9 ٪ بمقابلہ 20.8 ٪) کے ذریعہ صاف کیا جاتا ہے ، جس سے وائرل بائیو ایکٹیویٹی کے بہتر تحفظ کی نشاندہی ہوتی ہے۔
3. ویوو سیفٹی میں اچھا:ماؤس کنکال کے پٹھوں میں صاف شدہ AAV1 ویکٹروں کے مقامی انجیکشن کے بعد ، دو ہفتوں کے بعد کوئی خاص سوزش یا ٹشو کو نقصان نہیں پہنچا ، جس سے ویوو کی حفاظت میں اچھ .ا مظاہرہ کیا گیا۔
4. وسیع سیرٹائپ کا اطلاق:اس طریقہ کار نے AAV1 ، AAV5 ، AAV8 ، اور AAV9-from سیل کلچر سپرنٹنٹس سمیت متعدد سیرو ٹائپس - کو کامیابی کے ساتھ صاف کیا۔ تاہم ، AAV2 کے لئے ، جو بنیادی طور پر اعلی ناپاک بوجھ کے ساتھ سیل لیسیٹس میں موجود ہے ، مزید اصلاح کی ضرورت ہے۔

 

4. خلاصہ اور آؤٹ لک

اس مطالعے نے ایک سادہ ، تیز (1.5 گھنٹے) ، موثر اور توسیع پذیر نئے AAV طہارت کا عمل تیار کیا۔ سوڈیم ڈوکسائکولیٹ اور چیپس کو جوڑ کر ، اس نے ٹی ایف ایف صاف کرنے کے دوران بقایا پروٹین جمع کے چیلنج کو کامیابی کے ساتھ حل کیا۔

طریقہ کے فوائد میں شامل ہیں:

• سخت پییچ کے سخت حالات سے گریز کرنا ، وائرل سرگرمی کو بہتر طور پر محفوظ رکھنا
• کرومیٹوگرافی کے اقدامات کو کم کرنا ، ورک فلو کو آسان بنانا ، اور وقت اور اخراجات کی بچت کرنا
• آسانی سے توسیع پذیر ، صنعتی بڑے - پیمانے کی پیداوار کے لئے موزوں ہے
• دوسرے بائوماکومولیکولس جیسے ایکسوسومس ، دیگر وائرس ، اور دوبارہ پیدا ہونے والے اینٹی باڈیز کو پاک کرنے کے لئے ایک نئی حکمت عملی فراہم کرنا

موجودہ حدود میں سبوپٹیمل وائرل بازیافت اور خالی کیپسڈ کو مکمل وائرل ذرات سے الگ کرنے میں ناکامی شامل ہے ، جس سے یہ تجویز کیا جاتا ہے کہ اس کا بہترین استعمال ایک ملٹی - مرحلہ صاف کرنے والے ورک فلو میں پہلا - مرحلہ کیپچر کے طور پر ہوسکتا ہے۔

آخر میں ، یہ تحقیق بہاو AAV ویکٹر کی تیاری کے لئے ایک پرکشش نیا آپشن پیش کرتی ہے اور اس میں جین تھراپی کی دوائیوں کی لاگت کو نمایاں طور پر کم کرنے کی صلاحیت ہے ، جس سے ان کی وسیع تر اطلاق کی سہولت ہے۔