الٹرا فلٹریشن ٹیوب کے استعمال کے لیے احتیاطی تدابیر

(1) مناسب الٹرا فلٹریشن ٹیوب کا انتخاب کریں۔ عام طور پر، جو مالیکیولر وزن برقرار رکھا جائے وہ ہدف پروٹین کے مالیکیولر وزن کے 1/3 سے زیادہ نہیں ہونا چاہیے۔ مثال کے طور پر، اگر ہدف پروٹین کا مالیکیولر وزن 35kDa ہے، تو 10kDa سالماتی وزن والی الٹرا فلٹریشن ٹیوب کو منتخب کیا جا سکتا ہے۔ اگر ہدف پروٹین کا مالیکیولر وزن تقریباً 10kd ہے تو 3KD مالیکیولر وزن کے ساتھ الٹرا فلٹریشن ٹیوب استعمال کی جا سکتی ہے۔ ہدایات دستی کو احتیاط سے پڑھیں اور مختلف کیمیکلز کے لیے الٹرا فلٹریشن جھلی کی مختلف رواداری پر توجہ دیں۔

(2) نیا خریدا ہوا الٹرا فلٹریشن خشک ہے۔ استعمال سے پہلے انتہائی صاف پانی شامل کریں، اور پانی مکمل طور پر جھلی سے گزر جائے گا۔ اسے چند منٹ کے لیے برف کے غسل یا ریفریجریٹر میں پہلے سے ٹھنڈا کریں۔ پھر پانی ڈالیں اور پروٹین کا محلول شامل کریں۔ شامل کی گئی رقم ٹیوب کے اوپری حصے پر سفید لکیر سے زیادہ نہیں ہوگی۔ آپریشن ہلکا ہونا چاہئے۔ پروٹین کے محلول کو شامل کرنے سے پہلے، الٹرا فلٹریشن ٹیوب کو پری کولنگ کے لیے برف پر ڈالنے کی ضرورت ہے۔

(3) میزان۔ کشش ثقل کا ماس اور مرکز دونوں متوازن ہونا چاہیے۔ نوٹ کریں کہ رفتار اور سرعت زیادہ تیز نہیں ہونی چاہیے، ورنہ الٹرا فلٹریشن جھلی کو براہ راست نقصان پہنچے گا۔ سینٹرفیوگل الٹرا فلٹریشن شروع کریں (4 ڈگری پر سینٹرفیوج پری کولنگ)۔ مختلف سینٹری فیوجز کے RPM کو G میں تبدیل کرنے کے بعد، یہ مختلف ہے۔ جھلی پر دباؤ کو کم کرنے کے لیے سینٹری فیوج کی سرعت کو کم ترین گیئر پر ایڈجسٹ کریں۔ یاد رکھیں کہ سینٹری فیوج چھوڑنے سے پہلے آپ کو سنٹری فیوج کے ہدف کی رفتار تک پہنچنے تک انتظار کرنا چاہیے، ورنہ جب سینٹری فیوج میں کوئی مسئلہ ہو، تو آپ پہلی بار اس سے نمٹ نہیں سکتے۔ جھلی کی سمت اور گھومنے والی شافٹ کو ہدایات کے مطابق ایڈجسٹ کیا جانا چاہئے (زاویہ گھومنے والے سینٹری فیوج کی صورت میں، جھلی شافٹ پر کھڑی ہوتی ہے)۔ عملی استعمال میں، رفتار عام طور پر دستی سے کم ہوتی ہے، جو سینٹری فیوگل پائپ کی سروس لائف کو طول دے سکتی ہے۔

(4) جب اسے بقیہ 1 ملی لیٹر پر مرتکز کیا جائے تو 50ul بفر محلول لیں اور 10ul کو بہنے کے لیے شامل کریں تاکہ یہ دیکھیں کہ آیا یہ نیلا ہو جاتا ہے، تاکہ یہ فیصلہ کیا جا سکے کہ آیا الٹرا فلٹریشن ٹیوب پروٹین کو لیک کر رہی ہے۔ اگر ٹیوب لیک ہو جائے تو اوپری تہہ ڈالیں اور نئی ٹیوب میں بہہ جائیں اور الٹرا فلٹریشن شروع کریں۔ درست طریقے سے فیصلہ کرنے کے لیے کہ آیا ٹیوب لیک ہو رہی ہے، 10 منٹ کے لیے 5mgml BSA کے ساتھ سینٹری فیوج کریں، پھر بہاؤ لیں، پروٹین گلو یا بریڈ فورڈ کو کھردری پیمائش کے لیے چلائیں، اور ارتکاز کے لیے بقیہ پروٹین محلول شامل کرتے رہیں (برف پر چلائیں تاکہ پروٹین کو ہونے سے روکا جا سکے۔ گرم) جب تک کہ تمام مرتکز حل شامل نہ ہوجائیں۔ اس بات پر دھیان دیں کہ آیا سینٹرفیوگریشن کے دوران پروٹین کی بارش ہوتی ہے، جس کے نتیجے میں پائپ میں رکاوٹ پیدا ہوتی ہے۔ اگر بارش ہوتی ہے تو، ورن کی مخصوص وجہ کا تعین کریں، چاہے پروٹین کی مقدار بہت زیادہ ہے یا بفر نامناسب ہے۔ پہلے کو متعدد الٹرا فلٹریشن ٹیوبوں کے ساتھ بیک وقت الٹرا فلٹریشن کے ذریعے حل کیا جا سکتا ہے تاکہ ارتکاز کو کم کیا جا سکے۔ مؤخر الذکر مختلف بفر حلوں کو تبدیل کرنا ہے جب تک کہ پروٹین تیز نہ ہو۔

(5) پچھلے مراحل پروٹین کو مرکوز کرنے کے لیے استعمال کیے جاتے ہیں۔ اگر آپ بفر کو تبدیل کرنا چاہتے ہیں، جب کل ​​پروٹین محلول تقریباً 1ml تک مرتکز ہو جائے تو آہستہ سے ایک نیا بفر شامل کریں (0.22um الٹرا فلٹریشن میمبرین کے ذریعے الٹرا فلٹریشن)، اور پھر لگاتار تین بار تقریباً 1ml تک مرتکز کریں۔ آخری ارتکاز کا حتمی حجم پروٹین کے مطلوبہ ارتکاز پر منحصر ہے، جو عام طور پر 500ul سے زیادہ نہیں ہے، یا اسے 200ul سے کم تک مرکوز کیا جا سکتا ہے۔ ہر بار کم از کم 10 بار کے حجم کی حراستی کے مطابق، یہ 1000 سے زائد بار تین بار تک پہنچ سکتا ہے، جو بنیادی طور پر بفر کو تبدیل کرنے کا مقصد حاصل کرسکتا ہے.